划重点：脑组织冰冻切片mIHC实验的注意事项这一篇就够了！

脑组织的切片是研究大脑结构和功能的丰富材料。然而，未经处理的大脑是一个视觉上均匀的组织，就像一块空白的画布。

染色是一种“绘画”大脑的方法，利用神经元的特异性细胞标志物，研究者能识别表达神经细胞表型的细胞、特定基因、蛋白的表达特性，结合细胞形态特征，对神经元的类型、功能及在某些疾病中的异常表现有深入认识。

因此，神经科学研究领域细胞标志物（Marker）是我们用来对细胞定义和分选的重要标志。

本篇文章我们以小鼠的脑组织为例，带大家了解脑组织冰冻切片多重免疫组化实验。

小鼠的脑实质是一种柔软的组织，由丰富的胶原物质、血管网络与神经细胞构成，由于脑部血供的丰富，合格的取样前灌注与固定成为后期制片与染色成功与否的关键。

神经细胞通常根据种类以及病理情况的差异会表现出复杂的形态，石蜡切片所切出的5~10μm切片会增大神经细胞形态被破坏的概率，同时考虑对抗原的保护作用，使用冰冻切片法所制成的20μm切片可满足绝大多数情况下的组织染色。

灌注残留的血液通常是后期染色高背景的重要原因——准确的心脏灌流位点以及合适的灌注条件是必须的。通常制片过程中会遇到的问题如下：

（1）灌注、组织固定与脱水不充分

（2）切片出现划痕与裂痕

（3）贴片未充分舒展脑片致折叠

图片引自：Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

鉴于神经系统细胞标志物的复杂性，我们往往需要采取多标的技术。当多重标记和高通量光学显微镜相结合时，就能够提供完整生物系统的详细信息。

多重免疫标记技术是近年来病理学研究领域中兴起的一项重要技术方法，该方法是一项基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，可以在细胞或组织样本原位上检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用机理。

该项技术不仅可大幅提高被检测信号的灵敏度，同时也可解决了在同一张切片上进行多种同种属生物标志物检测的难题，通过定量病理分析可获得组织细胞原位各种靶标类别、组分、表达量等信息，各靶标及其相互作用的空间定位、定性和定量等信息，全面、系统、直观、科学地解析这些信息对于研究疾病的发生发展机制，对于探讨疾病诊断和治疗疾病的有效方法有着重要意义。

而皓赛拓华多重免疫组化染色试剂盒套组，采用自主研发并生产的霓虹DendronFluor®荧光E-TSA以及相关配套试剂,克服了传统多色荧光标记经常遇到的同源抗体问题，与普通TSA相比可成倍提升荧光信号、减少多轮标记的占位效应，节省更多抗体，并有市面上种类最多的荧光类型可选。

在某些病理条件下所观察的抗原通常表达于不止一种神经细胞，为了确定该抗原在某种兴趣细胞类型上的特定表达以及排除其他类型神经细胞，使用皓赛拓华冰冻切片试剂盒的最优解便是可以对某一抗原同时进行神经元以及多种胶质细胞抗原差异性表达的观察。

在神经环路的研究中，特定受体所表达的神经元的亚型被愈发重视，兴奋性神经元与抑制性神经元以及亚型的特定受体的表达差异经常是课题方向确定的重中之重。因此在同一张脑片上的多指标染色同样可以最客观的展示抗原靶标在多类型神经元上的表达差异

Unpublished data

另外，多重免疫组化染色的成功关键之一是抗体选择。

首先，一抗源性推荐使用兔单抗，可最大程度降低种属同源性问题导致的高背景与假阳性信号，其次再考虑鼠单抗。

根据多位用户的实验经验，他们的二抗首选皓赛拓华商用羊抗鼠/兔二抗，可有效降低非特异性信号。

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