骨组织石蜡切片免疫组化成功的关键在这儿！

    骨组织是一种坚硬的结缔组织，基质中含有大量无机酸盐，主要成分是80%磷酸钙、10%碳酸钙、2%柠檬酸钙及2%磷酸氢二钠，在组织制片时非常困难，也是所有组织中最难制片的组织。

    骨组织样本的充分脱钙和抗原保存往往是矛盾的。

    制片过程中常常会遇到骨组织脱钙不充分或混有碎骨的蜡块组织的制片，易出现切片撕开或碎裂，损伤刀刃，不能形成完整切片，或在染色过程中脱片，使制片失败。

    利用酸性脱钙液处理的骨组织样本虽然能充分脱钙，提高出片率，但是核酸、蛋白等关键分子结构破坏殆尽，只能看看组织的基本形态。但是，即便您费尽千辛万苦获得了一张完美的骨组织切片，微波、高压等剧烈的抗原修复方式让您的样本一夜回到解放前。

    什么？你还想做免疫荧光多标？

    呵呵~亲，这边建议您换个研究方向呢。

    良好的制片、保持形态完整、保存核酸/抗原永远是病理实验的基础。如果有小伙伴在研究骨组织或在骨科，想在骨组织切片上实现多分子靶标的研究，那这篇文章就是为你而写的！！

一、骨组织脱钙

    首先，一张合格的免疫组化切片必须以保存良好的抗原为基础。应用免疫组化法检测骨组织抗原在科研中首选脱钙剂是以EDTA为基础的螯合脱钙液。

    EDTA与羟基磷灰石结晶的外层钙结合，形成可溶性的非离子化合物，同时又促进晶体内层的结合钙向外转移，借助这种连续性的作用使羟基磷灰石晶体逐渐溶解。与酸性脱钙液相比，EDTA脱钙液不破坏核酸和蛋白质的结构，对DNA、RNA、蛋白抗原的保持是最完整的。实验中推荐您使用皓赛拓华脱钙液。

图为：使用皓赛拓华骨组织石蜡切片试剂盒套组骨组织染色成像

    方法：

   （1）骨样本准备是要去除多余的肌肉组织，于10%中性福尔马林或4%PFA固定12~24 hr。

   （2）固定时间少于8 hr会导致固定不充分，组织形态保存不完整，样品易脱片，不易耐受多轮染色和修复流程。固定时间超过3天会显著增加样本的自发荧光

   （3）固定后的样本置于50 mL EP管，倒入20~35 mL脱钙液（脱钙液体积须是样本的40倍以上），EP管固定在摇床或旋转混合仪，于室温脱钙。

   （4）12~24 hr换一次脱钙液，直至骨骼样本失去刚性，可以弯曲或手捏有弹性。

二、骨组织抗原修复

    其次，抗原修复和组织形态如何两者兼得？实验中推荐您使用皓赛拓华低温修复缓冲液

图为：使用皓赛拓华骨组织石蜡切片试剂盒套组骨组织染色成像

    皓赛拓华低温修复缓冲液利用专利技术，在50~72℃的条件下高效率将折叠和交联的抗原构象复原。您只需将切片放入烧杯等容器中，倒入低温修复缓冲液没过切片上沿，72度水浴6小时即可完成抗原修复。

    值得注意的是对于骨骼的组织学研究除了免疫组化之外，诸如H&E、DAB免疫组化等经典染色技术都可以使用皓赛拓华脱钙液，低温抗原修复液避免掉片。

·骨组织染色时，掉片严重怎么办？

    实验中使用皓赛拓华脱钙液，低温抗原修复液，AbCracker®洗脱缓冲液。

    我们针对骨组织石蜡切片实验的重点与难点，结合多年的操作经验，提出了一套骨组织染色全新的解决方案——《皓赛拓华骨组织石蜡切片说明书》中，从开始准备骨骼样品，到骨组织石蜡切片多色荧光标记，详细为大家介绍了骨组织染色的全过程。其中以小鼠后肢为例，列出了不同龄小鼠骨骼脱钙次数及时间，供大家参考。更多骨组织染色的实验步骤，注意事项，实验结果说明等内容读这一本就够了！

点击下载⏬骨组织石蜡切片.pdf